9.2.1
FÍSICOS
Basados en la introducción mecánica de las
moléculas en el interior de la célula:
r
MICROINYECCIÓN DIRECTA
Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa.
Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células
embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.
 |
| se muestra el metodo de microinyeccion directa. |
r
ELECTROPORACIÓN
'biolistic particle delivery'. Introducción
del DNA adherido a micropartículas que se disparan sobre las células.
Una vez introducida la molécula de DNA
recombinante en el interior de las células producirá su efecto permitiendo, seleccionar
células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de
clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto.
9.2.2 QUÍMICOS
Basados en la formación de complejos que las células sean
capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta
endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas
(lipofección).
MÉTODO
DEL FOSFATO CÁLCICO
Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro
de calcio y el DNA en una solución salina de
fosfatos. En esta situación precipitan formando unos agregados que son
endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio
protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la
calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve
afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.
MÉTODO
DEL DEAE DEXTRANO
Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE
y el DNA.
Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite
unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de
DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células
mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se
limita a las transfecciones transientes.
MÉTODO
DE LIPOFECCIÓN
Se basa en la formación de complejos entre lípidos
catiónicos y DNA.
El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la
entrada del
DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación de liposomas
a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se
emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido
catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por
ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para
obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70
y el 90% de las células de la placa.
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