jueves, 11 de abril de 2013

Resumen Unidad 2 Cultivo de tejidos vegetales


Para la realización de cultivos de tejidos vegetales es necesario realizar el medio de cultivo apropiado con los siguientes compontes: sales inorgánicas, fuente de carbohidratos, reguladores de crecimiento, vitaminas, aminoácidos, complejos orgánicos, reguladores de crecimiento vegetal, agua, etc., siendo uno de ellos el medio MS, que es el más conocido y apto para la mayoría de las especies. En el cual se realizan soluciones stock que se definen como soluciones concentradas de nutrientes agrupados según su afinidad química. Uno de los requerimientos para una adecuada realización del cultivo de tejidos vegetales es que el laboratorio cuente con las áreas necesarias como son: área de preparación, área de lavado y esterilización, área de siembra y el área de incubación cada una contando con su material y equipo preciso.

El medio MS está compuesto por soluciones stock de: nitratos, halógenos, PoBoMo, quelatos, orgánicos y sulfatos, los cuales para su preparación deben ser pesados de manera precisa y aforados con la cantidad de agua destilada que se desee preparar.

Por ejemplo para la preparación de sulfatos se necesita hacer una serie de cálculos:

MgSO4 7H2O à 0.370 gr/L (100X) = 37 gr/L (200) / 1000 = 7.4 gr
MnSO4 4H2O à 0.0169 gr/L (100X) = 1.69 gr/L (200) / 1000 = 0.338 gr
ZnSO4 7H2O à 0.0086 gr/L (100X) = 0.86 gr/L (200) / 1000 = 0.172 gr
CuSO4 5H2O à 0.000025 gr/L (100X) = 0.0025 gr/L / 1000 = 0.0005 gr

Terminado el pesado de los componentes se disuelven y se aforan. Ya que se cuentan con todas las soluciones stock se procede a preparar el medio de cultivo como tal, haciendo nuevamente una serie de cálculos para el volumen.

Por ejemplo:

Solución stock
Volumen ml (1L)
Nitratos
5
Sulfatos
10
Fosfa-bora-molib
10
Quelatos
10
Orgánicos
10
Halógenos
10
Sulfatos
1000ml à 10 ml
350 ml
à 3.5 ml






Obtenidos los cálculos se toma la cantidad indicada de cada una de las soluciones stock y se disuelven en agua destilada. Posteriormente se pesa, se añade y se agita la sacarosa y el phytagel calentando el medio para que este se disuelva, por último se vacía en frascos y se sellan, para su posterior esterilización.

La esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie se libera completamente de cualquier organismo vivo. Existen diferentes tipos o métodos de esterilización: métodos físicos y químicos.

Para el cultivo de tejidos es necesario esterilizar el material y el medio. Para esterilizar el material y el medio se utiliza la autoclave manejando el método físico por medio de vapor a una temperatura de 120°C por 20 minutos.

El cultivo de tejidos  vegetales consta de 5 fases o etapas según T. Murashgue: 

Etapa 0: selección de plantas donadoras de explantes
Etapa 1: establecimiento in vitro
Etapa 2: subcultivo (micropropagación)
Etapa 3: enraizamiento
Etapa 4: adaptación a condiciones ex vitro (aclimatación)

Cuando el explante ha sido cultivado se necesitan condiciones de  incubación y esta depende de varios factores: temperatura en donde la adecuada aproximadamente es de 25°C, luz (se utilizan lámparas de luz blanca con 2000 lux), fotoperiodo con alrededor de 12h luz/ 12h oscuridad (dependiendo el tipo de planta), humedad relativa constante de casi 100% y por último el área debe estar en condiciones asépticas.

Cuando se efectúa la siembra del explante este experimenta diferentes cambios fisiológicos, la plántula resultante del cultivo tendrá los estomas atrofiados, un parénquima desorganizado, sus raíces no son funcionales y las hojas presentaran un fenómeno denominado vitrificación el cual causa que las hojas presenten un color verde pálido y sean rugosas.

Por último para evitar que la planta muera en el traspaso al medio ambiente se realiza un proceso de aclimatación el cual consiste en adaptar fisiológicamente a la planta logrando que los estomas sean funcionales, las hojas se cortan y se generan nuevas siendo estas funcionales.

“El cultivo de tejidos vegetales es un proceso complejo comprendido de las etapas ya descritas en donde todas y cada una de ellas es de gran importancia para el éxito del cultivo.” 


miércoles, 20 de marzo de 2013

Tarea


Cuadro de las diferentes concentraciones de NaClO y tiempos para la desinfección de meristemos, hojas, semillas, y segmentos nodales (yemas)


Concentración
Tiempo
Meristemos
1%-1.2%
10 minutos
Hojas
2%
15 minutos
Semillas
1.2%
20 minutos
Segmentos nodales
5%
5 minutos

Bibliografía

ü  Turrialba (revista interamericana de ciencias agrícolas), Instituto interamericano de ciencias agricolas,Inter-American Institute of Agricultural Science.

ü  Alvarado, M., E. Salazar y J. G. Tejera. 1994. Cultivo in vitro de yemas apicales de guayaba (Psidium guajava L.). En resúmenes: V Congreso Nacional de Frutales. Maracay, Venezuela.

miércoles, 27 de febrero de 2013

Tarea


«Esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio superficie se libera completamente de cualquier microorganismo vivo.»

a)    RELACIÓN TEMPERATURA VS TIEMPO CON ESTERILIZACIÓN
TEMPERATURA
TIEMPO
180 ºC
30 minutos
170 ºC
60 minutos
160°C
120 minutos
150 ºC
150 minutos
140°C
180 minutos
120 ºC
6 horas

    b)    Efecto del tamaño (volumen) del recipiente sobre los tiempos de esterilización en autoclave para soluciones liquidas.
TAMAÑO DEL RECIPIENTE
VOLUMEN DEL LIQUIDO
TIEMPO DE ESTERILIZACIÓN (MIN)
Tubo de ensayo: 18 x 15 mm
10 ml
15
Erlenmeyer: 125 ml
95 ml
15
Erlenmeyer: 2 000 ml
1 5000 ml
30
Frasco de fermentación: 9 000 ml
67590 ml
70

Los tiempos de esterilización en la autoclave incluyen el tiempo necesario para que el contenido de los recipientes alcance las temperaturas de esterilización. En los recipientes más pequeños este tiempo es de 5 minutos o menos, pero en los frascos de 9 000 ml podría ser de 70 minutos. Un recipiente por lo general no se llena más allá del 75% de su capacidad.  

Bibliografía
ü Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case (2007). Introducción a la microbiología, novena edición, editorial medica Panamericana.
 ü http://www.mcgraw-hill.es/bcv/guide/capitulo/8448164180.pdf

viernes, 15 de febrero de 2013

TAREA: MEDIOS DE CULTIVO DEFINIDOS E INDEFINIDOS

MEDIOS DE CULTIVO DEFINIDOS

Son medios de cultivo que se caracterizan por su composición química es decirque se conoce exactamente la cantidad de cada uno de los compuestos que hay en el medio; se conocen tanto como (cualitativa y cuantitativamente) posteriormente se detallan algunos de los medios de cultivos.
               
1.      MEDIO  KNUDSON 
Macronutrientes
(NH4)2SO4
0.5 g/l
MgSO4
0.122 g/l
Ca(NO3)2 4H2O
0.694 g/l
KH2PO4
0.250 g/l
Micronutrientes
KI
0.83 mg/l
H3BO3
0.056 mg/l
MnSO4.H2O
5.68 mg/l
MoO3
0.016 mg/l
CuSO4.5H2O
0.062 mg/l
FeSO4.7H2O
25.0 mg/l















Para preparar el medio se pesa en una balanza analítica las cantidades de los compuestos señalados anteriormente y se disuelven en un litro de agua destilada, ajustar el pH a 5.5 luego se le agrega el agente gelificante (agar-agar o phytagel) y se calientan hasta que se hayan disuelto. Cuando el agente gelificante es agar se agrega la cantidad de 6,0 g/l y si se trata de phytagel se usa 2.0 g/l. Homogenizar el medio con agitación. Una vez preparado el medio se distribuye entre los recipientes que se van a utilizar, se tapan y se introducen a la autoclave para esterilizarlos a 121 °C por 20 minutos. El medio frío o solidificado puede guardarse en refrigeración hasta ser utilizado.


2.    MEDIO MS (MURASHIGE Y SKOOG)
Es el medio más conocido y se elaboró tomando el cultivo in vitro de tabaco como modelo. Es apto para la mayoría de las especies, por lo que es de amplia utilización, excepto para las más sensibles a la salinidad ya que se caracteriza por tener una elevada concentración salina.

Macronutrientes
NH4NO3
1.65 g/l
KNO3
1.9 g/l
MgSO4.7H2O
0.37 g/l
CaCl2.aq
0.33 g/l
KH2PO4
0.17 g/l
Micronutrientes
KI
0.83 mg/l
H3BO3
6.2 mg/l
MnSO4.4H2O
22.3 mg/l
ZnSO4.7H20
8.6 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0.25 mg/l
CuSO4.5H2O
0.025 mg/l
CoCl2.6H2O
0.025 mg/l
Na2.EDTA
37.3 mg/l
FeSO4.7H2O
3.   MEDIO HELLER
Este medio es usado para semillas  de Duraznero.
ZNSO4. 7H2O                          
 1 mg/L       
H3BO3                          
1 mg/L
MnSO4. 4H2O              
0.10 mg/L
CuSO4. 5H2O            
1.03  mg/L                    
Al Cl 3                        
0.03 mg/L
NiCl2.6H2O                
0.03  mg/L    
KI                               
0.01 mg/L

 4. MEDIO J-19
Sales B5
Cinetina
1.0 mg/L
ANA
1.0 mg/L
m-Inositol 
160 mg/L
Sacarosa
20 mg/L
pH
5.6

5.    MEDIO B5 (GAMBORG)
EL B5 fue formulado por Gamborg para cultivo  in vitro del callo de soja. Y este trabajó activamente en la elaboración de medios, a los que dio diferentes números.
Macro
(NH4)2SO4
0.134 g/l
KNO3
2.528 g/l
MgSO4.7H2O
0.246 g/l
CaCl2.aq
0.15 g/l
KH2PO4
0.15 g/l
Micro
KI
0.75 mg/l
H3BO3
3.0 mg/l
MnSO4.H2O
10 mg/l
ZnSO4.7H20
2.0 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0.25 mg/l
CuSO4.5H2O
0.025 mg/l
CoCl2.6H2O
0.025 mg/l
Na2.EDTA
37.3 mg/l
FeSO4.7H2O
27.8 mg/l

6.    MEDIO WHITE 
 Es un diluido complementario al medio MS y este fue elaborado para cultivo de raíces de tomate.
Macronutrientes
Ca(NO3)24H2O
0.3 g/l
KNO3
0.08 g/l
MgSO4.7H2O
0.72 g/l
Na2SO4
0.2 g/l
NaH2PO4.H2O
0.019g/l
Micronutrientes
KCl
65 mg/l
KI
0.75 mg/l
H3BO3
1.3 mg/l
MnSO4.7H2O
7 mg/l
ZnSO4.7H20
3 mg/l
Na2MoO4.2H2O
0.25 mg/l
CuSO4.5H2O
0.025 mg/l
CoCl2.6H2O
0.025 mg/l
Na2.EDTA
37.3 mg/l
FeSO4.7H2O
27.8 mg/l

7.    MEDIO J-19
Sales B5
Cinetina
1.0 mg/L
ANA
1.0 mg/L
m-Inositol 
160 mg/L
Sacarosa
20 mg/L
pH
5.6

8.    MEDIO WPM (LLOYD Y MCCOWN)
Se elaboró para el cultivo de tallos de plantas leñosas y arbustivas, tipos de plantas para las que está especialmente adaptado.


9.    MEDIO D2A
Medio VK-M
1.0 mg/L
ANA
1.0 mg/L
2,4-D
0.2 mg/L
ZEA
0.5 mg/L
10. MEDIO G-4
Sales B5
2,4-D
1.0 mg/L
BAP
0.5 mg/L
AIA
0.5 mg/L
Sacarosa
2.0 %

MEDIOS DE CULTIVO INDEFINIDOS

1. PREPARACIÓN DE AGAR CON EXTRACTO DE TRIGO, PAJA Y MALTA

Semillas de trigo 400 g
Extracto de malta 10 g
Paja de trigo 100 g
Agar-Agar 15 g
Dextrosa 10 g

Procedimiento:

Hervir el trigo en un litro de agua, dejando consumir el líquido hasta aproximadamente 500 ml, esto mismo se hace con la paja. Se filtran ambos extractos y se mezclan en un recipiente, se agrega los demás ingredientes y se le adiciona agua hasta ajustar un litro, esta suspensión se calienta hasta disolver todos los ingredientes. 

2. MEDIO DE CULTIVO IN VITRO PARA ORQUÍDEAS

Se utilizan 3 tomates maduros cortados en trozos
1 (plátano) maduro cortado en trozos
900 ml agua
100 ml agua de coco
4 tabletas de tiamina 300 mg (vitamina B1)
Grenetina o gelatina sin sabor

3. PREPARACIÓN DEL AGAR CON EXTRACTO DE MALTA

Extracto de Malta 10 g
Agar-Agar 15 g

Procedimiento:

Se pesan los ingredientes y se mezclan en el matraz con 1000 ml de agua destilada. La suspensión se calienta y agita hasta que queden totalmente disueltos los ingredientes.

4. AGAR FRIJOL LIMA

Frijol lima molido 100 g
Agar-Agar 20 g
Agua destilada para completar 1000 ml

Procedimiento:

Se remojan los frijoles (Phaseoluslimensis)por 30 minutos. Se hierven por 30 minutos a baño maría con suficiente agua; se filtra el agua a través de una gasa; se coloca el líquido nuevamente en baño maría, se agrega el agar y se agita el líquido hasta que el agar se disuelva, se restaura el volumen del líquido hasta 1000ml con agua destilada. 

5. AGAR JUGO V-8

Jugo V-8
Carbonato de calcio
Agar-Agar
Agua destilada

Bibliografía

1. http://cv.udl.cat/cursos/76304/t5/t5.htm
2.  Antonie Van Leeuwenhoek. 35 (Suppl): pp. G27-8... Jun 1969.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5312005?ordinalpos=&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.SmartSearch&log$=citationsensor. Consultado el 15 de febreo de 2013.