10.3 TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE GENES

Técnica que consiste en multiplicar un fragmento de ADN recombinante en una célula-huésped (generalmente una bacteria o una levadura) y aislar luego las copias de ADN así obtenidas.

Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen, entre otras.

Plásmidos	Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.
pUC18	Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas: - Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes. - Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula. - Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción. - Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes.
Bacteriófago lambda	El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas.
Cósmidos	Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos.
YAC	Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero
BAC	Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad (factor F) de bacterias.

Proceso para la clonación de un segmento de ADN

r Cortar al ADN en posiciones precisas con endonucleasas de restricción que actúan como tijeras moleculares.

r Unir los fragmentos obtenidos, proceso que hace naturalmente la ADN ligasa.

r Seleccionar una pequeña molécula de ADN capaz de autoreplicarse. Esto se logra utilizando plásmidos (u otros vectores de clonación). Las moléculas de ADN que están compuestas de material genético de diferentes fuentes se denominan ADNs recombinantes.

r Insertar los vectores de clonación a células específicas que contienen toda la maquinaria genética para la expresión de la información contenida en el vector.

r Seleccionar o identificar a las células que contienen al ADN recombinante