La
hibridación es la unión complementaria de ácidos nucleícos (ADN o ARN). Se
utiliza para detectar una molécula diana.
Existen dos tipos de hibridaciones de
ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan
técnicas de biología molecular.
Ambos
métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método
físico-químico, bien sea con radiactividad o con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza
como sonda para detectar
otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.
Southern
blot
El método fue desarrollado para la
detección de genes específicos en el ADN celular.
El ADN
es digerido con una enzima de
restricción y los fragmentos son
separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de
ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando
las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el
ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro
queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN
presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con
la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación
la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de
secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante
una exposición a una película de rayos
X para el caso de sondas
radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas.
Northern
El segundo método se utiliza para
identificar las cadenas de ARN de
secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo
Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para
identificar ARN.
El ARN
se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en
gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en
estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación
de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para
realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están
activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos
celulares.
Hibridación in
situ
Un desarrollo de las técnicas de
preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al
microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern
ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre
tejidos de material orgánico. Utilizando técnicas inmuno histoquímicas se puede conocer la localización
precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia
complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el
FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN
marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la
que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un
microscopio óptico de fluorescencia.
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