CONCLUSIÓN

Los objetivos planteados al comienzo de la unidad definieron que el estudiante entenderá las bases moleculares del intercambio del material genético entre los diferentes seres vivos para su posterior aplicación.

Para el intercambio del material genético existen diferentes mecanismos el natural y el método artificial. Para el primero existen 5 diferentes tipos: la transformación que consiste en adquirir DNA exógeno, es decir de otra bacteria que quizá fue lisada y hacerlo propio a través de la recombinación. Otro mecanismo natural es la conjugación que consiste en la combinación de DNA de una bacteria donadora (F+) a otra receptora (F-), pasándose un plásmido mediante un pili o puente. La transducción en esta actúan los fagos los cuales pasan la información genética de una bacteria a otra al introducir su material genético. Y por último de los mecanismos naturales esta la transfección la cual consiste en técnicas físicas para el intercambio del material genético.

En el mecanismo artificial  están los métodos físicos (introducción mecánica del material genético) y químicos (utilización de sustancias como: método del DEAE dextrano, método de lipofección y método del fosfato cálcico)  

REFERENCIAS

r http://www.profesorenlinea.cl/Ciencias/Bacteria.htm

r http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/17transforma.htm

r http://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/19transduccion.htm

9.2 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA ARTIFICIAL

9.2.1 FÍSICOS

Basados en la introducción mecánica de las moléculas en el interior de la célula:

r MICROINYECCIÓN DIRECTA

Es una técnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el método que se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos.

se muestra el metodo de microinyeccion directa.

r ELECTROPORACIÓN 

'biolistic particle delivery'. Introducción del DNA adherido a micropartículas que se disparan sobre las células. 

Una vez introducida la molécula de DNA recombinante en el interior de las células producirá su efecto permitiendo, seleccionar células que hayan incorporado el DNA. Este sería el caso del aislamiento de clones celulares que presentaran expresión de un determinado producto.

9.2.2 QUÍMICOS

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección).    

MÉTODO DEL FOSFATO CÁLCICO

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de  fosfatos. En esta situación precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.

MÉTODO DEL DEAE DEXTRANO

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA.

Los polímeros de DEAE dextrano  o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de

DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes.

MÉTODO DE LIPOFECCIÓN

Se basa en la formación de complejos entre lípidos catiónicos y DNA.

El complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del

DNA en el citosol. Una de las posibles vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap. Existen un gran número de lípidos que se emplean en lipofección, aunque existe una estructura consenso de un lípido catiónico sintético, a partir de la cual se han diseñado muchas variantes (por ej. DOPE). Es esencial optimizar las condiciones específicas de transfección para obtener buenas eficiencias, que suelen ser en buenas condiciones de entre el 70 y el 90% de las células de la placa.

9.1 MECANISMOS DE TRANSFERENCIA NATURAL

9.1.1 TRANSFORMACIÓN

La transformación como mecanismo de transferencia genética natural en bacterias es el proceso donde las bacterias toman DNA del medio circundante.

El ADN entra en el espacio periplasmático, entre la pared celular y la membrana plasmática, allí una endonucleasas corta las dobles hélices en fragmentos de menor tamaño y una de las cadenas se degrada de manera que lo que entra en el citiplasma es ADN de una hélice (monocatenario).

Cuando se realiza el mecanismo de transformación va acompañado del proceso de Recombinación, y esta se realiza cuando:

Los fragmentos de ADN monocatenario (exógeno) pueden sustituir el lugar del DNA bacteriano cuando este encuentra fragmentos de ADN homólogo, mediante un mecanismo de corte y ligamiento donde actúan las ligasas.

En la figura se puede observar el proceso de transformacion y recombinacion.

9.1.2 CONJUGACIÓN

Proceso en donde una bacteria donadora F+ (posee un plásmido, además del cromosoma bacteriano) transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. En donde se transmite un plásmido.

Se puede observar en la figura el proceso de conjugacion.

EN EL SIGUIENTE VIDEO SE DESCRIBE CON A MAYOR DETALLE CADA UNO DE LOS PASO DE LA CONJUGACION.

9.1.3 TRANSDUCCIÓN

En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

También podemos ver el proceso en esquema.

Sabemos que los fagos presentan dos ciclos de vida diferentes el ciclo lítico y el ciclo lisogénico.

Ciclo lítico: en este el fago introduce su material genético dentro de la bacteria, dentro de esta se van formando las estructuras de los fagos y posteriormente estas se ensamblan causando una lisis a la bacteria.

Ciclo lisogénico: ocurre el mismo proceso que en el ciclo lítico a excepción de que en este la bacteria no es lisada y el DNA del fago se une al DNA bacteriano,  a este se le llama profago. Cuando algún factor externo como pH, temperatura, etc., se altera o cambia el DNA del fago se activa lisando a la bacteria.

Es entonces ese fago resultado de la lisis en el ciclo lisogénico en que genera el proceso de transducción.

En la transducción podemos distinguir dos etapas diferenciadas:

1.     Formación de la partícula fágica transductora: un trozo de material genético de la célula donadora se introduce en el interior de la cabeza de la cápsida de un fago. Las partículas transductoras son en cierta manera “subproductos” anómalos del ciclo normal del fago.

2.     La partícula transductora inyecta de forma habitual el ADN que porta a la célula receptora, donde este ADN puede eventualmente recombinarse y expresar su información.

Existen dos tipos de transducción:

ü Transducción generalizada: Se caracteriza porque en ella se puede transferir cualquier trozo de genóforo bacteriano, con tal de que tenga un tamaño compatible con la capacidad de “empaquetado” de ADN de la cápsida del fago. La partícula transductora se forma por empaquetamiento anómalo de ADN genofórico bacteriano. En el interior de la cabeza del pseudovirión sólo existe ADN bacteriano, sin ADN del fago. Las partículas transductoras sólo se forman como consecuencia de infecciones líticas del fago.

ü Transducción especializada (restringida): Recordemos que fue descubierta por el equipo de Lederberg (1956), mientras hacían experimentos de inducción de células de E. coli lisogenizadas con el fago l. Este tipo de transducción consiste en la transferencia -mediatizada por fagos moderados producidos en la inducción de un cultivo lisogénico-, de un número limitado de marcadores, correspondientes a los loci genéticos adyacentes al sitio de integración del profago. La transducción restringida nunca ocurre por infecciones líticas. El ADN transducido va unido a ADN del fago.

9.1.4 RECOMBINACIÓN

Es el proceso por el cual una hebra de material genético es rota y luego unida a una molécula de material genético diferente.

9.1.5 TRANSFECCIÓN

Las técnicas de transfección celular, que se han desarrollado para permitir la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, han permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica y de la función de las proteínas en los sistemas celulares.

Las técnicas de transfección actuales se pueden clasificar en los llamados métodos físicos (se basan en el uso de sistemas mecánicos, no biológicos, para lograr la inserción de material genético en las células) y los métodos químicos.

En la figura se rseumen tres de los mecanismos de transferencia natural.

UNIDAD 9

INTRODUCCIÓN

Las bacterias son organismos unicelulares microscópicos, sin núcleo, que pueden presentarse desnudas o con una cápsula, aisladas o en grupos y que pueden tener cilios o flagelos.

La bacteria es el más simple y abundante de los organismos y puede vivir en tierra, agua, materia orgánica o en plantas y animales.

Morfología y estructura

Las bacterias son microorganismos procariontes (no poseen membrana nuclear por lo que su ADN está libre en la célula) de organización muy sencilla.

La célula bacteriana consta de:

ü Citoplasma: En su zona central aparece un nucleoide que contiene la mayor parte del ADN bacteriano, y en algunas bacterias aparecen fragmentos circulares de ADN con información genética, dispersos por el citoplasma: son los plasmidos.

ü Mesosomas: invaginaciones que presenta la membrana plasmática, donde se encuentran enzimas que intervienen en la síntesis de ATP, y los pigmentos fotosintéticos en el caso de bacterias fotosintéticas.

En el citoplasma se encuentran inclusiones de diversa naturaleza química.

Muchas bacterias pueden presentar flagelos generalmente rígidos, implantados en la membrana mediante un corpúsculo basal. Pueden poseer también fimbrias o pili muy numerosos y cortos, que pueden servir como pelos sexuales para el paso de ADN de una célula a otra

ü Poseen ARN y ribosomas característicos, para la síntesis de proteínas.

ü Pared celular, que es rígida y con moléculas exclusivas de bacterias.

Reproducción de las bacterias

Generalmente las bacterias se reproducen por bipartición.

Pero además de este tipo de reproducción asexual, las bacterias poseen unos mecanismos de reproducción sexual o parasexual, mediante los cuales se intercambian fragmentos de ADN.

Esta reproducción sexual o parasexual, puede realizarse por transformación, por conjugación o por transducción.

1.     TRANSFORMACIÓN: Consiste en el intercambio genético producido cuando una bacteria es capaz de captar fragmentos de ADN, de otra bacteria que se encuentran dispersos en el medio donde vive.

2.     CONJUGACIÓN: En este proceso, una bacteria donadora F+ transmite a través de un puente o pili, un fragmento de ADN, a otra bacteria receptora F-. La bacteria que se llama F+ posee un plasmido, además del cromosoma bacteriano.

3.     TRANSDUCCIÓN: En este caso la transferencia de ADN de una bacteria a otra se realiza a través de un virus bacteriófago, que se comporta como un vector intermediario entre las dos bacterias.

OBJETIVO

Entenderá las bases moleculares del intercambio del material genético entre los diferentes seres vivos para su posterior aplicación.

METODOLOGÍA 

Los apuntes de esta unidad serán ordenados conforme lo marca el temario, las investigaciones,  tareas y ensayos  se anexaran de acuerdo a la fecha de entrega, exigencias del profesor o si es posible acorde al temario, la bibliografía la expondré al final de la unidad en orden cronológico a los temas, al igual las conclusiones se incorporaran al final.

¿ES POSIBLE QUE LA MAQUINARIA EUCARIONTE DE TRADUCCION PUEDA TRADUCIR EL ARNm DE UNA BACTERIA?

NO. ¿Por qué?

La razón por la cual estoy en desacuerdo  de que un organismo eucarionte pueda traducir el ARNm de un organismo procarionte es porque cada uno de estos poseen características diferentes en la estructura de los ribosomas, en los eucariontes las subunidades son mayores que las procarioticas, además que estos últimos poseen tres subunidades (el sitio A o aceptor o aminoacilo, el sitio P, peptidil o donador y el sitio E o de eyección o salida) y los eucariontes solo tienen el sitio A y P.

Otra de las razones es la  secuencia de Shine-Dalgarno que es una secuencia de ARNm propia de la transcripción procariota en la etapa de iniciación.  En la traducción eucariota existe la CAPERUZA que empieza a recorrer el ARNm desde el extremo 5’ hasta el codón del comienzo.

Por esas razones pienso que no es posible que un eucariota pueda traducir un ARNm bacteriano.

r http://preujct.cl/biologia/curtis/libro/c14i.htm

CONCLUSIÓN

Como objetivo para esta unidad el alumno integrará los conocimientos anteriores con los mecanismos de regulación genética para entender a nivel molecular los procesos metabólicos. Ahora bien la presente unidad se estudiaron todos los procesos que intervienen y que ya se han estudiado en unidades anteriores y tratándolos de relacionar con la regulación genética, pues bien vemos que los niveles de la regulación génica viene dado por varios factores, que en la regulación de la transcripción también intervienen las hormonas las cuales envían señales que pueden alterar la transcripción de un gen, pero es la transcripción? es el proceso de obtención de un ARN mensajero (ARNm) a partir del ADN correspondiente a un gen. Otro de los procesos metabólicos y de regulación genética es la traducción de ese ARNm obtenido de la transcripción, es decir síntesis de proteínas, que también codifican caracteres que se expresan fenotípicamente y genotípicamente.

Otros factores o mecanismos en el proceso de regulación genética son los operones, un Operón es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores.  

Existe el operón lactosa que es de un tipo positivo ya que en esta se da la transcripción en presencia de lactosa en el medio. El operón triptófano es de tipo negativo ya que la RNApol actúa en ausencia de triptófano.

BIBLIOGRAFÍA

1.     http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/regulacion%20expresion%20genes.html

2.     http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/expresion.htm

3.     http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Operon/Operon.htm

4.    http://smcg.ccg.unam.mx/enp-unam/05TranscripYRegulacion/GutierrezRM_Regulacion.pdf

8.3 REGULACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN ORGANISMOS EUCARIÓTICOS

Los tipos de señales que pueden alterar la transcripción de un gen pueden ser:

Señales hormonales

Que interaccionan con un receptor de la membrana.  En el caso de las hormonas esteroideas, el receptor está dentro de la célula y es el conjunto hormona-receptor el que actúa de regulador.

Proteínas que modulan la transcripción

En eucariotas, pueden actuar como reguladores tanto moléculas de RNA como proteínas. Entre las proteínas, las hay que forman parte de la holoenzima polimerasa o sea los factores de transcripción.

1)    Activadores transcripcionales

Son proteínas que estimulan la expresión de genes.

2)    Coactivadores y correpresores

Los mecanismos por medio de los cuales se inhibe la transcripción es esencialmente:

r Se reduce a impedir que el complejo de iniciación llegue a un evento de elongación. Lo antes mencionado pude describirse más precisamente de la siguiente forma: en una primera etapa el represor puede bloquear la transición de complejo cerrado a complejo abierto.

3)    Transactivadores

Son aquellos que directamente ejercen su acción interaccionando con el complejo de iniciación formado en el promtor basal, bien sobre la propia polimerasa o, más normalmente, sobre una de las TAF o de los TFII, para activar o reprimir la transcripción, puesto que no son actividades exclulyentes.

Potenciadores

La mayoría de los ejemplos anteriores son reguladores del tipo SDE (secuencias distales específicas).

La fuente de regulación más potente es la de los elementos distales: los potenciadores (enhancers o intensificadores). Su función es la de amplificar la transcripción del promtor. Necesitan la mediación de un coactivador.

Final del formulSilenciamiento de genes

La unión inespecífica de proteínas reguladoras es un problema importante en los organismos con genomas grandes. Para combatirla, los eucariotas han hecho que los genes tengan en torno a 5 dianas para proteínas reguladoras diferentes.

El silenciamiento de un gen puede ocurrir por:

r la inactivación por interacción con un regulador

r el silenciamiento génico postranscripcional (PTGS, también denominada cosupresión o extinción génica)

r la metilación del DNA en vertebrados (directamente ligada al superenrollamiento y al silenciamiento).

 Inactivación mediante una proteína reguladora

Se consigue uniendo una proteína reguladora a cualquiera de los distintos elementos que forman los promotores.

PTGS: silenciamiento génico postranscripcional

Consiste en la degradación específica de los mRNA complementarios de una de las hebras del dsRNA.

Silenciamiento por metilación

No todos los organismos tienen el DNA metilado. Por tanto, los genes metilados no se pueden transcribir. Se trata de un mecanismo muy eficiente de silenciamiento génico que, además, disminuye la cantidad de DNA que los factores de transcripción y la RNA-polimerasa tienen que rastrear para buscar los promotores.

8.4.2 OPERON DE TRIPTOFANO

El operón triptófano es un sistema de tipo represible, ya que el aminoácido triptófano (Correpresor) impide la expresión de los genes necesarios para su propia síntesis cuando hay niveles elevados de triptófano. Sin embargo, en ausencia de triptófano o a niveles muy bajos se transcriben los genes del operón trp. Los elementos del operón triptófano son en esencia semejantes a los del operón lactosa:

v Genes estructurales: existen cinco genes estructurales en el siguiente orden trpE-trpD-trpC-trpB-trpA.

v Elementos de control: promotor (P) y operador (O). El promotor y el operador están al lado de los genes estructurales y en el siguiente orden: P O trpE-trpD-trpC-trpB-trpA. Curiosamente, las enzimas codificadas por estos cinco genes estructurales actúan en la ruta metabólica de síntesis del triptófano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma.

v Gen regulador (trpR): codifica para la proteína reguladora. Este gen se encuentra en otra región del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del operón.

v Correpresor: triptófano.

Elementos del Operón Triptófano

En ausencia de triptófano, o cuando hay muy poco, la proteína reguladora no es capaz de unirse al operador de forma que la ARN-polimerasa puede unirse a la región promotora y se transcriben los genes del operón triptófano. Es un operón negativo ya que la proteína puede unirse al operador en ausencia de triptofano y así comenzar la transcripción.

Operón triptófano: en ausencia de triptófano

En presencia de triptófano, à el triptófano se une a la proteína reguladora o represora cambiando su conformación, de manera que ahora si puede unirse a la región operadora y como consecuencia la ARN-polimerasa no puede unirse a la región promotora y no se transcriben los genes estructurales del operón triptófano.

Por tanto, la diferencia esencial entre el operón lactosa (positivo) y el operón triptofano (negativo), es que en este último el represor del triptófano solamente es capaz de unirse al operador cuando previamente está unido al triptófano.

8.2.1 OPERÓN DE LACTOSA

Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema de la lactosa en E. coli, de manera que los resultados de sus estudios permitieron establecer el modelo genético del Operón que permite comprender como tiene lugar la regulación de la expresión génica en bacterias.

“Un Operón es grupo de genes estructurales cuya expresión está regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores”.

Los principales elementos que constituyen un operón son los siguientes:

ü Los genes estructurales: llevan información para polipéptidos. Se trata de los genes cuya expresión está regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, son poligénicos o policistrónicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene estructural

ü El promotor: elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentra antes de los genes estructurales.

ü El operador: elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la proteína reguladora. Se sitúa entre la región promotora y los genes estructurales.

ü El gen regulador: secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que reconoce la secuencia de la región del operador. El gen regulador está cerca de los genes estructurales del operón pero no está inmediatamente al lado.

ü Proteína reguladora: proteína codificada por el gen regulador. Está proteína se une a la región del operador.

ü Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresión de los genes.

El Operón lactosa, es un sistema inducible que está bajo control negativo, de manera que la proteína reguladora, producto del gen regulador, es un represor que impide la expresión de los genes estructurales en ausencia del inductor. El inductor del sistema es la lactosa.

En la figura se muestra que en el operón lactosa el represor está situado en el operador deteniendo que la RNA polimerasa actué.

 Sin embargo, en presencia del inductor (la lactosa), este se une a la proteína reguladora que cambia su conformación y se suelta de la región operadora dejando acceso libre a la ARN-polimerasa para que se una a la región promotora y se transcriban los genes estructurales. Por consiguiente, la presencia del inductor hace que se expresen los genes estructurales del operón, necesarios para metabolizar la lactosa.

Operón lactosa en presencia de lactosa

También es conveniente recordar que los tres genes estructurales del operón lactosa se transcriben juntos en un mismo ARNm, es decir que los ARN mensajeros de bacterias suelen ser policistrónicos, poligénicos o multigénicos.

Operón lactosa: ARNm multigénico o policistrónico