PRACTICA: EXTRACCION Y SEPARACION DE DNA

RESUMEN

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla, consiste en primer lugar, romper las membranas celulares para liberar núcleos. Para ello se tritura el tejido en este caso el hígado en el mortero.

Al añadir una solución hipertónica como el NaCl se produce un rompimiento de los núcleos. El detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del ADN. El alcohol tiene como función la de precipitar el ADN, que se va agrupando para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista.

ABSTRACT

The DNA can be isolated by a relatively simple technique is to first break the cell membranes to release cores. For this tissue is ground in this case the liver in a mortar.
By adding a hypertonic solution such as NaCl is a breakdown of the nuclei. The detergent forms a complex with proteins and DNA separates. The alcohol has the function of precipitating the DNA, to be grouped to give rise to the formation of white fibers visible to the naked eye.  

ANTECEDENTES

Además del agua, los carbohidratos, las proteínas y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son biomoléculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas, son moléculas complejas producidas por células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo delo cuerpo y sus características especificas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteínas.

OBJETIVO

Extraer DNA y RNA de tejidos animales y vegetales e identificarlos como tales.

MATERIAL

ü  Tubos de centrifuga 1 ml

ü  Tubos de ensayo de 5 ml

ü  Centrifuga

ü  MicroPipetas de 1000 y 200 ul

ü  Agua destilada esteril (20 ml para todos)

ü  Etanol al 100% frio (20 ml)

ü  NaCl 3M

ü  Buffer de extracción de ADN (urea, NaCl, EDTA, 20 mles suficiente para todos)

ü  Fenol (20 ml es suficiente, manéjese con guantes)

ü  Mortero y pistilo

ü  Aguacate, cacahuate, hígado, carne, sangre.

ü  Papel aluminio

ü  Cleenpack

ü  Guantes

PROCEDIMIENTO

a)    Rompimiento de membranas y paredes celulares

Toma una muestra del tejido (5 gr. Aprox.) que hayas elegido y homogeneízalo, es decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro licúalo en seco.

b)    Digestión

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox.) en un tubo de eppendorf de 1 ml y agragale el buffer de extracción (tris –HCl 0.05 M, EDTA 0.02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M) a temperatura ambiente de cuarto (500 ul aprox.).

Cuando hayas agregado el buffer de extracción a tu muestra agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

c)    Separación de proteínas, carbohidratos y lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agregale 500 ul. De fenol frio usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Extrae la fase acuosa (500 ul aprox.) con una micropipeta, sino se separan las fases centrifuga a 10 000 rpm por 5 minutos, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

d)    Precipitación de ácidos nucleicos ADN y ARN 

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colócala en un tubo eppendorf limpio y agrégale 400 ul. De etanol  (100%) frio y 75 ul de NaCl 3 M. mezcla por inversión, suave y observa cómo se precipita el ADN.

Recuperación de la pastilla

Centrifuga tu tubo por 3 minutos a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

Resuspención

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.

CUESTIONARIO

Investiga por que el DNA se separa en presencia de alcohol frio.

El ADN es insoluble en alcohol, lo cual origina que en presencia de éste se aglutine o "se precipite".  Por esa razón es que en prácticas de extracción de ADN se utiliza el alcohol frio.

¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría, o la observación directa con fluorescencia después de teñir el gel de extracción con bromuro de etidio. (Método de saram wrap, método del plato de agarosa, método del mini-gel) o por fluorometria.

¿Cuál es su función e importancia del ADN en los organismos?

El ADN es un elemento esencial que desempeña funciones diversas. Es la biomolécula que controla el desarrollo del cuerpo y sus características específicas ya que esta proporciona la información hereditaria e inducen la producen las proteínas.