Ma. Evelyn: junio 2012

domingo, 10 de junio de 2012

CONCLUSIÓN

En la unidad anterior se estudiaron las técnicas que son utilizadas en biología molecular y se pudo observar que todas ellas son en torno al ADN, en donde las principales técnicas son las siguientes: Southern blot que es un método que detecta genes específicos en el ADN, utilizando enzimas de restricción y sondas. La técnica de clonación de genes consiste en multiplicar un fragmento de ADN recombinante en una célula huésped para aislar y obtener más copias, para que esto se lleve a cobo se utilizan vectores y pueden ser virus, fagos, plásmidos, etc.

La PCR, reacción en cadena de polimerasa es también una de las técnicas que son utilizadas en biología molecular y el diagnostico de enfermedades causadas por virus, bacterias y otros microorganismos, esta consiste en crear copias de un solo fragmento de ADN en donde se puede detectar una cadena viral (si es el caso).

Una de las técnicas más importantes es la del DNA recombinante y esta nos permite obtener fragmentos de ADN de cantidades limitadas y que este a su vez puede ser incorporado a la secuencia del DNA de otro organismo, dándose así un hibrido.

BIBLIOGRAFÍA

o http://escuela.med.puc.cl/paginas/publicaciones/boletin/html/laboratorio/laboratorio10.html

o http://www.upc.com.mx/laboratorio/molecular

o http://genmolecular.wordpress.com/tecnicas-de-biologia-molecular/

o http://www.biologia.arizona.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_1/01t.html

o http://www.vetpraxis.net/2010/06/22/diagnostico-de-enfermedades-infecciosas/

o http://www.arrakis.es/~ibrabida/vigcorte.html

10.5 TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

La tecnología del DNA recombinante nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias, etc.) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes.

Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden cortar el ADN.

Corte del DNA

Acción de las enzimas de restriccion

2. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción (son endonucleasas que hidrolizan en una forma específica puentes fosfodiéster 3' - 5'.), se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento, un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

3. En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

Diferentes enzimas de restriccion

10.4 PRUEBA DE PCR EN EL DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS POR MICROORGANISMOS (BACTERIANAS, PROTOZOARIOS, ENTRE OTROS)

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se convirtió rápidamente en unaherramienta esencial para el diagnóstico de organismos de enfermedades infecciosas. Las técnicas de PCR, las más utilizadas hasta la fecha, son capaces de detectar tanto DNA como mRNA vírico.

La prueba de PCR es generalmente considerada como sensible y específica al igual que el cultivo, es significativamente más rápida y, para algunos organismos, es más confiable.

A continuación, se presenta una lista de algunos organismos infecciosos que ahora pueden detectarse mediante la PCR:

ü VIH-1*

ü Clamidia *

ü Hepatitis C *

ü Hepatitis B *

ü Neisseria gonorrhoeae *

ü Virus del papiloma humano *

ü Virus herpes simplex I, II *

ü Citomegalovirus *

ü Dengue

ü Mycobacterium tuberculosis

ü Helicobacter pylori

ü Borrelia burgdorferi

ü Enterovirus Virus

ü Virus del Nilo Occidental

ü Virus de la Influenza A H1N1 (Aprobada por la FDA).

La técnica de PCR permite detectar una copia viral en un millón de células, especialmente en aquellas con un bajo número de copias víricas, como es el caso de la infección oculta.

Desventaja

El problema más importante de las técnicas de amplificación genómica es la contaminación de la reacción con ADNs extraños, en cualquiera de sus fases, produciendo falsos resultados.

Otra desventaja de la reacción de PCR es la no amplificación de genomas cuando no existen "primers" específicos, con la imposibilidad de detectar nuevos tipos de HPVs.

Ventaja

La ventaja diagnóstica de la prueba de PCR, que copia secciones específicas del ADN de un organismo, sobre el cual podría existir una enfermedad.

10.3 TÉCNICAS DE CLONACIÓN DE GENES

Técnica que consiste en multiplicar un fragmento de ADN recombinante en una célula-huésped (generalmente una bacteria o una levadura) y aislar luego las copias de ADN así obtenidas.

Hay muchos vectores de clonación, que difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen, entre otras.

Plásmidos	Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas.
pUC18	Es un plásmido muy utilizado, ya que presenta unas características que son muy beneficiosas: - Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes. - Tiene un origen de replicación y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula. - Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción. - Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes.
Bacteriófago lambda	El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas.
Cósmidos	Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos.
YAC	Los YAC son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero
BAC	Un BAC es un cromosoma artificial bacteriano, basado en el plásmido de fertilidad (factor F) de bacterias.

Proceso para la clonación de un segmento de ADN

r Cortar al ADN en posiciones precisas con endonucleasas de restricción que actúan como tijeras moleculares.

r Unir los fragmentos obtenidos, proceso que hace naturalmente la ADN ligasa.

r Seleccionar una pequeña molécula de ADN capaz de autoreplicarse. Esto se logra utilizando plásmidos (u otros vectores de clonación). Las moléculas de ADN que están compuestas de material genético de diferentes fuentes se denominan ADNs recombinantes.

r Insertar los vectores de clonación a células específicas que contienen toda la maquinaria genética para la expresión de la información contenida en el vector.

r Seleccionar o identificar a las células que contienen al ADN recombinante

10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

La hibridación es la unión complementaria de ácidos nucleícos (ADN o ARN). Se utiliza para detectar una molécula diana.

Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular.

Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con radiactividad o con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.

Southern blot

El método fue desarrollado para la detección de genes específicos en el ADN celular.

El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película sensible a la luz, para el caso de sondas.

Northern

El segundo método se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para identificar ARN.

El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.

Hibridación in situ

Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. Utilizando técnicas inmuno histoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio óptico de fluorescencia.

10.1 MÉTODOS DE PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

ELECTROFORESIS

Para la obtención y separación de fragmentos de ADN es necesario recabar muestras de ADN las cuales tendrán que ser lisadas en buffer una vez obtenido es necesario separar el ADN con el resto de las biomoléculas como las proteínas la cual se realiza con solventes orgánicos como el fenol o cloroformo. Para la detección de un fragmento en específico es necesario que los fragmentos de ADN resultantes se separen según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia un electrodo positivo. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo a su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina. Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero efluirá de la columna al cambiar al pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del intercambiador iónico, respectivamente; primero efluirán de la columna las moléculas cargadas positivamente que no se unen a la fase estacionaria y posteriormente, al añadir el tampón de elución, efluirán las moléculas con poca carga negativa neta y luego las de mayor carga negativa neta.

UNIDAD 10

INTRODUCCIÓN

¿A QUE SE DENOMINAN TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR?

En principio se denominan así a todas las técnicas de laboratorio que se utilizan para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver en el estado que se encuentra, cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas (clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada región con enzimas de restricción, que significa diferencias en los tamaños de los fragmentos de restricción debido a poliformismos en el ADN entre otras.

Técnicas empleadas en biología molecular

Utilización de nucleasas de restricción

Rotura especifica de ADN, facilita el aislamiento y la manipulación de los genes.

Hibridación de los ácidos nucleícos

Hace localizar secuencias determinadas de DNA o ARN, utilizando la capacidad que tienen estas moléculas de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleícos.

Clonación del ADN

Se puede conseguir que un fragmento de DNA se inerte en un elemento genético autorreplicante (virus o plásmidos) que habita una bacteria, de tal manera que una molécula de DNA puede ser reproducida generando muchos miles de millones de copias genéticas.

En general, las técnicas más usadas son las de detección directa por hibridación, usando un segmento de ADN marcado, y las técnicas de amplificación. Estas últimas han tenido una verdadera explosión en su metodología, como lo demuestra el que en la actualidad existan por lo menos seis técnicas diferentes, aunque todas tienen como finalidad la amplificación de un segmento de ADN o ARN que ha sido seleccionado como un marcador para una determinada patología.

OBJETIVO

Conocerá y aplicará las bases moleculares del ADN para su manipulación y en el mejoramiento genético de especies de interés alimenticio, medico y ecológico.

METODOLOGÍA

Los apuntes de esta unidad serán ordenados conforme lo marca el temario, las investigaciones, tareas y ensayos se anexaran de acuerdo a la fecha de entrega, exigencias del profesor o si es posible acorde al temario, la bibliografía la expondré al final de la unidad en orden cronológico a los temas, al igual las conclusiones se incorporaran al final.

lunes, 4 de junio de 2012

UNIDAD 9: LAS BACTERIAS DE DIFERENTES ESPECIES PUEDEN COMPARTIR UN PLÁSMIDO MEDIANTE TRANSFORMACIÓN?

Las bacterias emplean diversos métodos de recombinación que permiten transferir genes entre especies diferentes. Un proceso conocido como transformación permite a las baterías capturar DNA libre del ambiente. Durante el proceso, las bacterias intercambien piezas circulares de ADN, llamadas plásmidos localizados en el citoplasma de muchas bacterias.

Las bacterias pueden tomar los plásmidos que han sido liberados mediante la destrucción de otras bacterias, y así adquieren plásmidos del ADN de diferentes especies.

El tamaño de los plásmidos varía entre 1000 y 10 0000 nucleótidos de longitud. En comparación con el cromosoma de E. coli tiene una longitud aproximada de 4 600 000 nucleótidos. Una sola bacteria puede contener docenas o incluso cientos de copias de un plásmido. Cuando la bacteria muere libera los plásmidos en el ambiente, donde pueden ser capturados por bacterias de la misma o de otra especie.

Uno de los experimentos que sustentan mi decisión es el de Lederberg en colaboración con Tatum (1946) descubrió la recombinación genética en la bacteria Escherichia coli. Esta se reproduce asexualmente, pero de vez en cuando dos bacterias intercambian unas cadenas cortas de DNA llamadas plásmidos. Más tarde se supo que incluso dos bacterias de especies distintas son capaces de intercambiar plásmidos. Aunque este experimento explica el método de conjugación lo que quiero recalcar es que si es posible que bacterias de distintas especies intercambien material genético.

REFERENCIAS

ühttp://books.google.com.mx/booksd=x7Pjp233nJ0C&pg=PA171&lpg=PA171&dq=bacterias+de+distintas+especies+pueden+tomar+plasmidos&source=bl&ots=uRr_C9WQ0k&sig=7ExIilmqMglKgtIO3u8LWyV6-Y4&hl=es&sa=X&ei=bJzKT-nsNOjy2QWg-PjZCw&ved=0CEQQ6AEwAA#v=onepage&q=bacterias%20de%20distintas%20especies%20pueden%20tomar%20plasmidos&f=false

ü http://idiomamedico.com/infopremiosnobel.php?id=1&ano=1958

UNIDAD 8: ¿COMO SE REALIZA EL CONTROL GENICO DEL GEN BRCA?

Los genes BRCA 1 y BRCA 2 son genes humanos que pertenecen a una clase de genes conocidos como supresores de tumores.

En condiciones normales las células, los genes BRCA1 y BRCA2, ayudan a asegurar la estabilidad del material genético de la célula y ayuda a prevenir el crecimiento celular descontrolado. La mutación de estos genes está relacionada con el desarrollo de cáncer de mama y de ovario.

El gen BRCA1 está situado en el cromosoma 17 y el gen BRCA 2 se encuentra en el cromosoma 13.

Sabemos que la modulación y regulación tanto de la expresión génica como de su traducción está dada por varios factores. En el caso de los genes BRCA1 y BRCA2 está regulada en el ciclo celular.

Donde el gen p53 es el represor, se encuentra en el brazo corto del cromosoma 17 y en la banda del cromosoma 13, y codifica una proteína nuclear. La función del P53 en estado normal es la de regulación del ciclo celular ante un daño del DNA, por lo que se le ha denominado "guardián del genoma". Cuando el DNA se daña, el P53 se acumula en el núcleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 antes que se duplique el DNA e iniciar su reparación.

P53 va a inducir la síntesis de proteínas inhibidoras de los complejos ciclina-CDKs, bloqueando el ciclo celular. Si se repara la lesión el ciclo continúa, pero si no se repara se induce la apoptosis de la célula mediante la expresión de genes.

La alteración de la proteína P53 produce inestabilidad genómica, siendo las células incapaces de evitar la proliferación o activar la apoptosis, cuando está comprometida la integridad del ADN, de manera que son capaces de acumular las mutaciones para completar la carcinogénesis.