PRACTICA: EXTRACCION Y SEPARACION DE DNA

RESUMEN

El ADN se puede aislar mediante una técnica relativamente sencilla, consiste en primer lugar, romper las membranas celulares para liberar núcleos. Para ello se tritura el tejido en este caso el hígado en el mortero.

Al añadir una solución hipertónica como el NaCl se produce un rompimiento de los núcleos. El detergente forma un complejo con las proteínas y las separa del ADN. El alcohol tiene como función la de precipitar el ADN, que se va agrupando para dar lugar a la formación de unas fibras blancas visibles a simple vista.

ABSTRACT

The DNA can be isolated by a relatively simple technique is to first break the cell membranes to release cores. For this tissue is ground in this case the liver in a mortar.
By adding a hypertonic solution such as NaCl is a breakdown of the nuclei. The detergent forms a complex with proteins and DNA separates. The alcohol has the function of precipitating the DNA, to be grouped to give rise to the formation of white fibers visible to the naked eye.  

ANTECEDENTES

Además del agua, los carbohidratos, las proteínas y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

Los ácidos nucleicos (ADN y ARN) son biomoléculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas, son moléculas complejas producidas por células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo delo cuerpo y sus características especificas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteínas.

OBJETIVO

Extraer DNA y RNA de tejidos animales y vegetales e identificarlos como tales.

MATERIAL

ü  Tubos de centrifuga 1 ml

ü  Tubos de ensayo de 5 ml

ü  Centrifuga

ü  MicroPipetas de 1000 y 200 ul

ü  Agua destilada esteril (20 ml para todos)

ü  Etanol al 100% frio (20 ml)

ü  NaCl 3M

ü  Buffer de extracción de ADN (urea, NaCl, EDTA, 20 mles suficiente para todos)

ü  Fenol (20 ml es suficiente, manéjese con guantes)

ü  Mortero y pistilo

ü  Aguacate, cacahuate, hígado, carne, sangre.

ü  Papel aluminio

ü  Cleenpack

ü  Guantes

PROCEDIMIENTO

a)    Rompimiento de membranas y paredes celulares

Toma una muestra del tejido (5 gr. Aprox.) que hayas elegido y homogeneízalo, es decir muelelo con el mortero, si el tejido es muy duro licúalo en seco.

b)    Digestión

Coloca tu muestra molida (1 gr aprox.) en un tubo de eppendorf de 1 ml y agragale el buffer de extracción (tris –HCl 0.05 M, EDTA 0.02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M) a temperatura ambiente de cuarto (500 ul aprox.).

Cuando hayas agregado el buffer de extracción a tu muestra agítala e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

c)    Separación de proteínas, carbohidratos y lípidos

A la mezcla que tienes en tu tubo de ensayo agregale 500 ul. De fenol frio usa guantes y no inhales los vapores.

Agita vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, deja reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Extrae la fase acuosa (500 ul aprox.) con una micropipeta, sino se separan las fases centrifuga a 10 000 rpm por 5 minutos, ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extrae la fase acuosa superior una vez centrifugada.

d)    Precipitación de ácidos nucleicos ADN y ARN 

A la fase acuosa que extrae (500 ul), colócala en un tubo eppendorf limpio y agrégale 400 ul. De etanol  (100%) frio y 75 ul de NaCl 3 M. mezcla por inversión, suave y observa cómo se precipita el ADN.

Recuperación de la pastilla

Centrifuga tu tubo por 3 minutos a 3000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

Resuspención

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.

CUESTIONARIO

Investiga por que el DNA se separa en presencia de alcohol frio.

El ADN es insoluble en alcohol, lo cual origina que en presencia de éste se aglutine o "se precipite".  Por esa razón es que en prácticas de extracción de ADN se utiliza el alcohol frio.

¿Cómo podrías cuantificar la cantidad de DNA de tu muestra?

Para cuantificación del ADN se hace uso de la espectrofotometría, o la observación directa con fluorescencia después de teñir el gel de extracción con bromuro de etidio. (Método de saram wrap, método del plato de agarosa, método del mini-gel) o por fluorometria.

¿Cuál es su función e importancia del ADN en los organismos?

El ADN es un elemento esencial que desempeña funciones diversas. Es la biomolécula que controla el desarrollo del cuerpo y sus características específicas ya que esta proporciona la información hereditaria e inducen la producen las proteínas.

CONCLUSIÓN

Los objetivos planteados al principio de la unidad fueron que el estudiante:

v Entenderá como se transmite la información genética entre los seres vivos y su relación con los mecanismos de herencia.

v Distinguirá los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y eucariotas.

De acuerdo con estos me atrevo a expresar que ahora sé que la replicación del ADN es semiconservativa es decir, que posee una cadena nueva y una antigua,  modelo que fue propuesto por Meselson y Stahl. Que en procariotas es bidireccional, ya que a partir del punto de origen progresa en dos direcciones opuestas llamadas horquillas de replicación, tiene una la hélice conductora (hélice líder), mientras que la otra hélice se sintetiza de manera discontinua, hélice retardada o rezagada, en la cual se forman los fragmentos de Okazaki.  Para que se lleve a cabo la replicación del ADN se necesita de muchas enzimas (Helicasa, Topoisomeras, RNA polimerasa, DNA polimerasa III, DNA polimerasa I, Ligasa, Proteínas SSBP) que sintetizan en el sentido 5´à3´.  En eucariotes la replicación es muy similar a la de los procariotas salvo algunas diferencias, existe más de un origen de replicación, los fragmentos de Okasaki son más largos, poseen enzimas diferentes como la topoisomerasa en la que existe la I y II, tienen ADN polimerasa a, b, g, d y e, entre otras.

La replicación in vitro se realiza con PCR que es un proceso sintético por así decirlo en el que se copia un gen o parte de este en una maquina llamada termociclador en el cual el proceso es muy simple en solo en tres pasos: se calienta el ADN a 90°C o 95°C para separar las cadenas, se enfría a 70°C o 72°C para añadir al cebador y por último Taq polimerasa (enzima utilizada para la replicación in vitro) complementa los nucleótidos.  

BIBLIOGRAFÍA

o  Mary K. Campbell,Shawn O. Farrell, Bioquímica. Editorial Cengage learning. 30/11/2006 - 844 páginas.

o  Helena Curtis, Sue James, Adriana Schnek. Biología, editorial médica panamericana, séptima edición.

o  Página dedicada a la adquisición de conocimiento biológico http://fbio.uh.cu/sites/genmol/confs/conf4/p1.htm

o  Página dedicada a la adquisición de conocimiento biológico http://mpf.biol.vt.edu/research/budding_yeast_model/pp/intro.php

o  Página dedicada a la adquisición de conocimiento biológico http://bioserv.fiu.edu/~biolab/labs/genetics/dna%20processes.htm

o  Página dedicada a la adquisición de conocimiento biológico http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/Dibulgeneral/PCR/PCR.htm

4.4 REPLICACION IN VITRO DEL ADN (PCR)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que imita la habilidad natural de la célula de duplicar el ADN.

Se trata de una técnica usada para crear un gran número de copias de un segmento de ADN, que utiliza ciclos de desnaturalización  a 94-95 ° C (calentamiento del ADN para su rompimiento o separación de las cadenas), se enfría para agregar los cebadores y extensión por una ADN polimerasa termoresistente sintetizando en el sentido 5´à 3´ (Ver figura 6).

Figura 6

Hasta la década de 1980, el único método para obtener grandes cantidades de un fragmento de ADN era clonándolo en vectores adecuados e introduciéndolo y multiplicándolo en bacterias. En el año 1985, un investigador norteamericano, Kary Mullis, desarrolló un método que permite, a partir de una muestra muy pequeña de ADN, obtener millones de copias de ADN in vitro, en unas pocas horas y sin necesidad de usar células vivas. Esta técnica, llamada reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requiere conocer la secuencia de nucleótidos de los extremos del fragmento que se quiere amplificar. Estas secuencias se usan para diseñar dos oligonucleótidos sintéticos de ADN complementarios a una porción de cada una de las dos cadenas de la doble hélice.

4.3. CONTROL DE LA REPLICACIÓN

El ciclo celular es la sucesión de los acontecimientos mediante el cual una célula crece y se divide en dos células hijas que contienen cada uno la información y la maquinaria necesaria para repetir el proceso. Entre la división celular y el siguiente, todos los componentes esenciales de la célula debe ser duplicado. El componente más importante es el material genético (moléculas de ADN presentes en los cromosomas), que debe ser replicado con precisión y las dos copias cuidadosamente separados para las dos células hijas. Los procesos de replicación del ADN y la separación cromátida hermana ocurrir en fases temporalmente diferentes del ciclo de célula eucariota. Estos se conocen como la fase S (síntesis de ADN) y M fase-(mitosis), En general, S y M fases separadas por dos lagunas, conocidas como G1 y G2.



Saccharomyces cerevisiae

La levadura unicelular, Saccharomyces cerevisiae, es un sistema modelo para estudiar la regulación del ciclo celular. Como una célula de levadura que progresa a través del ciclo celular, se detendrá en dos puestos de control principales:

 

• El punto de control G1: Si se detecta el daño del ADN, la feromona de apareamiento está presente, o la célula no ha alcanzado el tamaño crítico, las detenciones de células en G1 y es incapaz de experimentar la transición de arranque que compromete a la célula a una nueva ronda de síntesis de ADN y la mitosis.

•  El puesto de control conjunto del husillo: Si se detecta daño en el ADN, el ADN no se replica por completo, o cromosomas no están alineados en la placa de metafase, las detenciones de células en metafase y es incapaz de someterse la transición acabado, con lo que cromátidas hermanas se separan y se divide la célula .

Figura 5 ciclo celular de la levadura

Estos puntos de control son ejecutadas por los complejos CDK / ciclina, una familia de proteínas quinasas. La subunidad catalítica de estos complejos, la quinasa dependiente de ciclina (CDK), sólo se activa cuando se combina con una subunidad de ciclina regulatoria. En la levadura en ciernes, sólo hay una Cdk (llamada Cdc28), y nueve diferentes ciclinas (Cln1-3, CLB1-6). Según el socio de la ciclina, dímeros Cdc28/cyclin realizar tareas específicas y diferentes. Progresión adecuada a través del ciclo celular requiere la activación sucesiva y la inactivación de estos dímeros Cdc28/cyclin. Hay varios mecanismos diferentes para la regulación de Cdc28 actividad en la célula, a saber:

 

 A través de la síntesis de las ciclinas de diversos factores de transcripción (SBF, MBF y MCM1).

A través de la degradación de las ciclinas, promovida por Cdc20/APC, Cdh1/APC y Grr1/SCF). ´

Mediante la asociación con estequiométricas inhibidores de CDK (Sic1 y Cdc6, y FAR1).

través de la fosforilación y la desfosforilación de Cdc28 por SWE1 y Mih1.

 

Las proteínas reguladoras que controlan la actividad de Cdc28 y garantizar la correcta progresión del ciclo celular.

Práctica: Extracción de DNA

Higado

Higado molido

Sangre

Añadiendo buffer

Centrifugando

Resultado de la centrifugación

Separando el DNA.

DNA

Gradilla improvisada con todas las muestras

4.2 REPLICACIÓN DEL GENOMA EUCARIOTICO

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. (Ver imagen 3). Existe una hebra conductora que sintetiza de manera continua y la retardada de forma discontinua con fragmentos de Okazaki. Sin embargo, la replicación en eucariotas presenta ciertas peculiaridades:

v El ADN de los eucariontes está fuertemente asociado a los octámeros de histonas, en forma de nucleosomas, por lo que además de replicarse el ADN, deben duplicarse también las histonas. Al parecer, tanto los nuevos nucleosomas como los antiguos se reparten de manera aleatoria entre las dos nuevas hebras hijas: en la retardada y en la conductora.

v La longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que el ADN bacteriano, de ahí que no haya un único origen de replicación. Para que el proceso sea más rápido, existen numerosas burbujas de replicación a lo largo de cada cromosoma.

4.1 REPLICACIÓN DEL GENOMA PROCARIÓTICO

La replicación es un proceso muy complejo pero se desarrolla con gran constancia.

Figura 1

La replicación del ADN en procariotas es bidireccional, ya que a partir del punto de origen progresa en dos direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación (Ver figura 1).

Cuando se mira solamente una de las horquillas de replicación, una de las hélices se sintetiza de forma continua, la hélice conductora (también llamada hélice líder), mientras que la otra hélice se sintetiza de manera discontinua, hélice retardada (también llamada hélice retrasada), a base de fragmentos cortos o fragmentos de OKAZAKI.

Como una hélice se sintetiza de forma continua y la otra lo hace de forma discontinua, se dice que la replicación es semidiscontinua.

Para la replicación del ADN se necesitan actividades enzimáticas que llevan a cabo, sólo son capaces de hacerlo en sentido 5´à3´.

La copia de secuencias de millones de pares de bases se realiza con una tasa de errores prácticamente insignificante.

Componentes necesarios:

Ø  Desoxirribonucleotidos trifosforilados: dATP, dGTP, dCTP y dTTP (millones)

Ø Proteínas: Proteínas de iniciación y fijación SSBP (Single Strand Binding Protein = Fijación a la cadena).

Ø  Enzimas:

ü   Helicasa: Rompe puentes de hidrógeno

ü   Topoisomerasa: Elimina tensiones y superenrrollamientos

ü   RNA polimerasa:  Síntesis de Cebador: ARN (10-30)

ü   DNA polimerasa III : LA REINA REPLICA: Conductora

ü   DNA polimerasa I: Reparadora y sustituye al cebador

ü   Ligasa: Une los fragmentos de Okazaki de la retrasada.

FASES REPLICACIÓN PROCARIOTAS

A)   Iniciación

B)    Elongación

C)    Terminación

Figura 2

En las bacterias existe un solo origen de replicación, denominado Ori C y, a partir de este único punto de origen, la replicación progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación.

A)    INICIACIÓN

o  Reconocimiento del “sitio de inicio” de la replicación.

o  Separación de las cadenas parentales de ADN

o  Estabilización parcial de esas cadenas como cadenas sencillas de ADN (Proteínas SSB).

Se forma el “Complejo de iniciación”: Comienza la síntesis del ARN cebador o primer tanto en la cadena retardada como en la cadena conductora.

B)    ELONGACIÓN

o  La ADN Polimerasa III actúa en ambas cadenas.

o  Se forman la cadena continua y fragmentos de Okazaki discontinuos.

C)    TERMINACIÓN

o  La ADN Polimerasa I degrada los cebadores y los reemplaza por ADN complementario.

o  La ADN ligasa une todos los fragmentos de ADN de Okazaki. (ver figura 3)

Figura 3