Para la realización de cultivos de tejidos vegetales es
necesario realizar el medio de cultivo apropiado con los siguientes compontes:
sales inorgánicas, fuente de carbohidratos, reguladores de crecimiento, vitaminas,
aminoácidos, complejos orgánicos, reguladores de crecimiento vegetal, agua,
etc., siendo uno de ellos el medio MS, que es el más conocido y apto para la mayoría
de las especies. En el cual se realizan soluciones stock que se definen como soluciones
concentradas de nutrientes agrupados según su afinidad química. Uno de los requerimientos
para una adecuada realización del cultivo de tejidos vegetales es que el
laboratorio cuente con las áreas necesarias como son: área de preparación, área
de lavado y esterilización, área de siembra y el área de incubación cada una
contando con su material y equipo preciso.
El medio MS está compuesto por soluciones stock de:
nitratos, halógenos, PoBoMo, quelatos, orgánicos y sulfatos, los cuales para su
preparación deben ser pesados de manera precisa y aforados con la cantidad de
agua destilada que se desee preparar.
Por ejemplo para la preparación de sulfatos se necesita
hacer una serie de cálculos:
MgSO4 7H2O à 0.370 gr/L (100X) = 37 gr/L (200) / 1000 = 7.4 gr
MnSO4 4H2O à 0.0169 gr/L (100X) = 1.69 gr/L (200) / 1000 = 0.338 gr
ZnSO4 7H2O à 0.0086 gr/L (100X) = 0.86 gr/L (200) / 1000 = 0.172 gr
CuSO4 5H2O à 0.000025 gr/L (100X) = 0.0025 gr/L / 1000 = 0.0005 gr
Terminado
el pesado de los componentes se disuelven y se aforan. Ya que se cuentan con
todas las soluciones stock se procede a preparar el medio de cultivo como tal,
haciendo nuevamente una serie de cálculos para el volumen.
Por
ejemplo:
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Solución
stock
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Volumen
ml (1L)
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Nitratos
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5
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Sulfatos
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10
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Fosfa-bora-molib
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10
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Quelatos
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10
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Orgánicos
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10
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Halógenos
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10
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Sulfatos
1000ml à 10 ml
350 ml à 3.5 ml
350 ml à 3.5 ml
Obtenidos
los cálculos se toma la cantidad indicada de cada una de las soluciones stock y
se disuelven en agua destilada. Posteriormente se pesa, se añade y se agita la
sacarosa y el phytagel calentando el medio para que este se disuelva, por último
se vacía en frascos y se sellan, para su posterior esterilización.
La
esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio o
superficie se libera completamente de cualquier organismo vivo. Existen diferentes
tipos o métodos de esterilización: métodos físicos y químicos.
Para
el cultivo de tejidos es necesario esterilizar el material y el medio. Para esterilizar
el material y el medio se utiliza la autoclave manejando el método físico por
medio de vapor a una temperatura de 120°C por 20 minutos.
El
cultivo de tejidos vegetales consta de 5
fases o etapas según T. Murashgue:
Etapa 0: selección de plantas
donadoras de explantes
Etapa 1: establecimiento in
vitro
Etapa 2: subcultivo (micropropagación)
Etapa 3: enraizamiento
Etapa 4: adaptación a
condiciones ex vitro (aclimatación)
Cuando
el explante ha sido cultivado se necesitan condiciones de incubación y esta depende de varios factores:
temperatura en donde la adecuada aproximadamente es de 25°C, luz (se utilizan lámparas
de luz blanca con 2000 lux), fotoperiodo con alrededor de 12h luz/ 12h
oscuridad (dependiendo el tipo de planta), humedad relativa constante de casi
100% y por último el área debe estar en condiciones asépticas.
Cuando
se efectúa la siembra del explante este experimenta diferentes cambios fisiológicos,
la plántula resultante del cultivo tendrá los estomas atrofiados, un parénquima
desorganizado, sus raíces no son funcionales y las hojas presentaran un fenómeno
denominado vitrificación el cual causa que las hojas presenten un color verde pálido
y sean rugosas.
Por último para
evitar que la planta muera en el traspaso al medio ambiente se realiza un
proceso de aclimatación el cual consiste en adaptar fisiológicamente a la
planta logrando que los estomas sean funcionales, las hojas se cortan y se
generan nuevas siendo estas funcionales.
“El cultivo de tejidos vegetales es un proceso complejo comprendido
de las etapas ya descritas en donde todas y cada una de ellas es de gran
importancia para el éxito del cultivo.”
