Práctica: Extracción de DNA

Higado

Higado molido

Sangre

Añadiendo buffer

Centrifugando

Resultado de la centrifugación

Separando el DNA.

DNA

Gradilla improvisada con todas las muestras

4.2 REPLICACIÓN DEL GENOMA EUCARIOTICO

Es similar a la de los procariontes, es decir, semiconservativa y bidireccional. (Ver imagen 3). Existe una hebra conductora que sintetiza de manera continua y la retardada de forma discontinua con fragmentos de Okazaki. Sin embargo, la replicación en eucariotas presenta ciertas peculiaridades:

v El ADN de los eucariontes está fuertemente asociado a los octámeros de histonas, en forma de nucleosomas, por lo que además de replicarse el ADN, deben duplicarse también las histonas. Al parecer, tanto los nuevos nucleosomas como los antiguos se reparten de manera aleatoria entre las dos nuevas hebras hijas: en la retardada y en la conductora.

v La longitud del ADN de un cromosoma eucariótico es mucho mayor que el ADN bacteriano, de ahí que no haya un único origen de replicación. Para que el proceso sea más rápido, existen numerosas burbujas de replicación a lo largo de cada cromosoma.

4.1 REPLICACIÓN DEL GENOMA PROCARIÓTICO

La replicación es un proceso muy complejo pero se desarrolla con gran constancia.

Figura 1

La replicación del ADN en procariotas es bidireccional, ya que a partir del punto de origen progresa en dos direcciones opuestas, existiendo dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación (Ver figura 1).

Cuando se mira solamente una de las horquillas de replicación, una de las hélices se sintetiza de forma continua, la hélice conductora (también llamada hélice líder), mientras que la otra hélice se sintetiza de manera discontinua, hélice retardada (también llamada hélice retrasada), a base de fragmentos cortos o fragmentos de OKAZAKI.

Como una hélice se sintetiza de forma continua y la otra lo hace de forma discontinua, se dice que la replicación es semidiscontinua.

Para la replicación del ADN se necesitan actividades enzimáticas que llevan a cabo, sólo son capaces de hacerlo en sentido 5´à3´.

La copia de secuencias de millones de pares de bases se realiza con una tasa de errores prácticamente insignificante.

Componentes necesarios:

Ø  Desoxirribonucleotidos trifosforilados: dATP, dGTP, dCTP y dTTP (millones)

Ø Proteínas: Proteínas de iniciación y fijación SSBP (Single Strand Binding Protein = Fijación a la cadena).

Ø  Enzimas:

ü   Helicasa: Rompe puentes de hidrógeno

ü   Topoisomerasa: Elimina tensiones y superenrrollamientos

ü   RNA polimerasa:  Síntesis de Cebador: ARN (10-30)

ü   DNA polimerasa III : LA REINA REPLICA: Conductora

ü   DNA polimerasa I: Reparadora y sustituye al cebador

ü   Ligasa: Une los fragmentos de Okazaki de la retrasada.

FASES REPLICACIÓN PROCARIOTAS

A)   Iniciación

B)    Elongación

C)    Terminación

Figura 2

En las bacterias existe un solo origen de replicación, denominado Ori C y, a partir de este único punto de origen, la replicación progresa en dos direcciones, de manera que existen dos puntos de crecimiento (PC) u horquillas de replicación.

A)    INICIACIÓN

o  Reconocimiento del “sitio de inicio” de la replicación.

o  Separación de las cadenas parentales de ADN

o  Estabilización parcial de esas cadenas como cadenas sencillas de ADN (Proteínas SSB).

Se forma el “Complejo de iniciación”: Comienza la síntesis del ARN cebador o primer tanto en la cadena retardada como en la cadena conductora.

B)    ELONGACIÓN

o  La ADN Polimerasa III actúa en ambas cadenas.

o  Se forman la cadena continua y fragmentos de Okazaki discontinuos.

C)    TERMINACIÓN

o  La ADN Polimerasa I degrada los cebadores y los reemplaza por ADN complementario.

o  La ADN ligasa une todos los fragmentos de ADN de Okazaki. (ver figura 3)

Figura 3

Unidad 4

INTRODUCCION

La replicación del ADN produce una copia de sí mismo por medio de enzimas que además de ser muy exactas poseen un sistema de reparación de errores. El mecanismo de replicación es esencialmente el mismo en todas las células. Es un proceso semiconservativo porque cada uno de los dos ADN hijos tiene una cadena del ADN anterior.

En eucariotas, el proceso es esencialmente el mismo pero el ADN es mucho más grande y linear. Hay varios orígenes de replicación y es bidireccional. El avance es más lento que en procariotas ya que hay más proteínas asociadas al ADN que hay que soltar. La replicación del ADN, que ocurre una sola vez en cada generación celular necesita de muchos "ladrillos", enzimas y una gran cantidad de energía en forma de ATP. La replicación del ADN en el ser humano se realiza a una velocidad de 50 nucleótidos por segundo. Los nucleótidos tienen que ser armados y estar disponibles en el núcleo conjuntamente con la energía para unirlos.

Una vez que se abre la molécula, se forma una área conocida como "burbuja de replicación" en ella se encuentran las "horquillas de replicación". Por acción de la ADN polimerasa los nuevos nucleótidos entran en la horquilla y se enlazan con el nucleótido correspondiente de la cadena de origen (A con T, C con G). Los procariotas abren una sola burbuja de replicación, mientras que los eucariotas múltiples. El ADN se replica en toda su longitud por confluencia de las "burbujas".

Dado que las cadenas del ADN son antiparalelas, y que la replicación procede solo en la dirección 5' a 3' en ambas cadenas, numerosos experimentos han mostrado que, una cadena formará una copia continua, mientras que en la otra se formarán una serie de fragmentos cortos conocidos como fragmentos de Okazaki. La cadena que se sintetiza de manera continua se conoce como cadena guía, delantera ó adelantada y, la que se sintetiza en fragmentos, cadena atrasada ó rezagada.

Los fragmentos cortos, recién sintetizados de hebras de ADN se denominan fragmentos Okazaki. Todas las ADN polimerasas conocidas, pueden sólo sintetizar ADN en la dirección 5' a 3’. Sin embargo, cuando las hebras se separan, la horquilla de replicación se desplaza a lo largo de una hebra molde en la posición 3' a 5' y 5' a 3' en el otro lado del molde.

En la primera, la cadena adelantada de ADN es sintetizada continuamente en la dirección 5' a 3'. En la otra, llamada la cadena atrasada, la síntesis de ADN sólo ocurre cuando una sección de una hebra simple de ADN ha sido expuesta y procede en la dirección opuesta a la dirección de la horquilla de replicación (5' a 3'). Es por esto discontinua y la serie de fragmentos Okazaki son unidos de manera covalente por las ligasas formando una hebra continua. Se denominan fragmentos Okazaki porque fué éste investigador quien primeramente los observó y estudió usando timidina radioactiva. En los eucariotas, los fragmentos Okazaki están formados por unos cuantos cientos de nucleótidos, mientras que en los procariotas estos fragmentos pueden alcanzar algunos miles.

Para que la ADN polimerasa trabaje, se necesaria la presencia, en el inicio de cada nuevo fragmento, de pequeñas unidades de ARN conocidas como cebadores, a posterior, cuando la polimerasa toca el extremo 5' de un cebador, se activan otras enzimas, que remueven los fragmentos de ARN, colocan nucleótidos de ADN en su lugar y una ADN ligasa que los une a la cadena en crecimiento.

OBJETIVOS

o  Entenderá como se transmite la información genética entre los seres vivos y su relación con los mecanismos de herencia.

o  Distinguirá los mecanismos de duplicación del material genético en procariotas y eucariotas.

METODOLOGIA

Los apuntes de clase de esta unidad serán ordenados conforme lo marca el temario, las investigaciones y las tareas se anexaran de acuerdo a la fecha de entrega, exigencias del profesor o si es posible acorde al temario, la bibliografía la expondré al final de la unidad en orden cronológico a los temas, es decir conforme se fueron investigando, al igual las conclusiones se incorporaran al final.

DESARROLLO

RESUMEN MESELSON Y STAHL, SÍNTESIS DEL DNA ES SEMICONSERVATIVA

La propiedad más notable de las células vivas es su capacidad de reproducirse con una fidelidad casi perfecta, no solamente una generación, sino durante centenares y millares de generaciones. El modelo que explica cómo se duplica el DNA se denomina modelo semiconservativo ya que a partir de una molécula de ADN obtendremos dos exactamente iguales, cada una con una hebra antigua (cadena parda en la imagen siguiente) y otra nueva (cadena naranja en la imagen siguiente): la cadena original comienza a separarse de un extremo a otro de modo que cada una de las hélices va a sintetizar una hélice nueva complementaria habiendo tomado como modelo o patrón a la hélice inicial.

Anteriormente se conocían modelos de replicación alternativos:

Q   Uno de ellos una doble hélice se replica sin perder su integridad, dando lugar a una doble hélice cuyas cadenas son ambas de nueva síntesis. (b)

Q   En otro el resultado de la replicación de una hélice antigua son dos hélices cuyas cadenas contienen fragmentos del ADN antiguo mezclados con ADN de nueva síntesis. (a)

Meselson y Stahl (1958) demostraron que el DNA de E. coli se replica de forma semiconservativa, tal como habían propuesto Watson y Crick (1953) al elaborar el modelo molecular del DNA y tal como podía deducirse de los experimentos realizados previamente por Taylor (1957) sobre la síntesis de DNA en eucariotas. El experimento de Meselson y Stahl está basado en la variación de la densidad de flotación del DNA derivada de la utilización del isótopo pesado del nitrógeno (N15) y el análisis de dicha variación mediante la técnica de ultracentrifugación en gradiente de Cloruro de Cesio.

La clave del experimento de Meselson y Sthal residía en que su diseño les permitía distinguir un ADN previamente sintetizado y otro de nueva síntesis. Para conseguirlo, etiquetaban uno que otro tipo de ADN con diferentes isotopos de nitrógeno. Permitieron el crecimiento de un cultivo de Escherichia coli en presencia del isotopo pesado del nitrógeno N15, y otro en presencia del isotopo ligero N14.

para complementacion, ver pag.

REFERENCIAS

ü Pagina para la adquisición de conocimiento. http://www.bionova.org.es/animbio/anim/meselson/intromeselson.swf

Examen Unidad 3