Resumen Unidad 2 Cultivo de tejidos vegetales

Para la realización de cultivos de tejidos vegetales es necesario realizar el medio de cultivo apropiado con los siguientes compontes: sales inorgánicas, fuente de carbohidratos, reguladores de crecimiento, vitaminas, aminoácidos, complejos orgánicos, reguladores de crecimiento vegetal, agua, etc., siendo uno de ellos el medio MS, que es el más conocido y apto para la mayoría de las especies. En el cual se realizan soluciones stock que se definen como soluciones concentradas de nutrientes agrupados según su afinidad química. Uno de los requerimientos para una adecuada realización del cultivo de tejidos vegetales es que el laboratorio cuente con las áreas necesarias como son: área de preparación, área de lavado y esterilización, área de siembra y el área de incubación cada una contando con su material y equipo preciso.

El medio MS está compuesto por soluciones stock de: nitratos, halógenos, PoBoMo, quelatos, orgánicos y sulfatos, los cuales para su preparación deben ser pesados de manera precisa y aforados con la cantidad de agua destilada que se desee preparar.

Por ejemplo para la preparación de sulfatos se necesita hacer una serie de cálculos:

MgSO₄ 7H₂O à 0.370 gr/L (100X) = 37 gr/L (200) / 1000 = 7.4 gr

MnSO₄ 4H₂O à 0.0169 gr/L (100X) = 1.69 gr/L (200) / 1000 = 0.338 gr

ZnSO₄ 7H₂O à 0.0086 gr/L (100X) = 0.86 gr/L (200) / 1000 = 0.172 gr

CuSO₄ 5H₂O à 0.000025 gr/L (100X) = 0.0025 gr/L / 1000 = 0.0005 gr

Terminado el pesado de los componentes se disuelven y se aforan. Ya que se cuentan con todas las soluciones stock se procede a preparar el medio de cultivo como tal, haciendo nuevamente una serie de cálculos para el volumen.

Por ejemplo:

Solución stock	Volumen ml (1L)
Nitratos	5
Sulfatos	10
Fosfa-bora-molib	10
Quelatos	10
Orgánicos	10
Halógenos	10

Sulfatos

1000ml à 10 ml
350 ml à 3.5 ml

Obtenidos los cálculos se toma la cantidad indicada de cada una de las soluciones stock y se disuelven en agua destilada. Posteriormente se pesa, se añade y se agita la sacarosa y el phytagel calentando el medio para que este se disuelva, por último se vacía en frascos y se sellan, para su posterior esterilización.

La esterilización es el proceso mediante el cual cualquier material, sitio o superficie se libera completamente de cualquier organismo vivo. Existen diferentes tipos o métodos de esterilización: métodos físicos y químicos.

Para el cultivo de tejidos es necesario esterilizar el material y el medio. Para esterilizar el material y el medio se utiliza la autoclave manejando el método físico por medio de vapor a una temperatura de 120°C por 20 minutos.

El cultivo de tejidos  vegetales consta de 5 fases o etapas según T. Murashgue: 

Etapa 0: selección de plantas donadoras de explantes

Etapa 1: establecimiento in vitro

Etapa 2: subcultivo (micropropagación)

Etapa 3: enraizamiento

Etapa 4: adaptación a condiciones ex vitro (aclimatación)

Cuando el explante ha sido cultivado se necesitan condiciones de  incubación y esta depende de varios factores: temperatura en donde la adecuada aproximadamente es de 25°C, luz (se utilizan lámparas de luz blanca con 2000 lux), fotoperiodo con alrededor de 12h luz/ 12h oscuridad (dependiendo el tipo de planta), humedad relativa constante de casi 100% y por último el área debe estar en condiciones asépticas.

Cuando se efectúa la siembra del explante este experimenta diferentes cambios fisiológicos, la plántula resultante del cultivo tendrá los estomas atrofiados, un parénquima desorganizado, sus raíces no son funcionales y las hojas presentaran un fenómeno denominado vitrificación el cual causa que las hojas presenten un color verde pálido y sean rugosas.

Por último para evitar que la planta muera en el traspaso al medio ambiente se realiza un proceso de aclimatación el cual consiste en adaptar fisiológicamente a la planta logrando que los estomas sean funcionales, las hojas se cortan y se generan nuevas siendo estas funcionales.

“El cultivo de tejidos vegetales es un proceso complejo comprendido de las etapas ya descritas en donde todas y cada una de ellas es de gran importancia para el éxito del cultivo.”